Déchiffrer le code de l’ubiquitine au cours de la mitose

L’ubiquitine est une petite protéine qui peut être attachée à des protéines cibles afin de réguler leur devenir comme par exemple lors de la mitose qui permet la création de deux cellules filles identiques à partir d’une cellule mère. De nombreuses combinaisons de molécules d’ubiquitine sont possibles et définissent le « code de l’ubiquitine ». L’équipe d’Izabela Sumara au sein de l’institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire a identifié un mécanisme permettant de déchiffrer ce code dans les cellules humaines au cours de la mitose. Ces travaux sont publiés dans la revue Developmental Cell.

'Au cours de la mitose, les chromosomes, qui contiennent l’information génétique, sont tout d’abord copiés puis partagés de manière égale dans les deux cellules filles. Une mauvaise régulation de ce processus peut contribuer au développement de cancers. L’un des mécanismes importants contrôlant la progression mitotique est l’attachement de la petite protéine ubiquitine à des protéines cibles. L’addition d’ubiquitine (ubiquitination) est une modification transitoire qui peut conduire soit à la dégradation de la protéine cible soit à la régulation de sa fonction. De nombreux arrangements et combinaisons de molécules d’ubiquitine isolées ou sous forme de chaines connectées sont possibles et définissent le « code de l’ubiquitine ». Cependant, les mécanismes cellulaires permettant son décodage dans les cellules humaines au cours de la mitose restent largement inexplorés.
L’équipe d’Izabela Sumara avait identifié au cours d’une étude précédente des évènements d’ubiquitination contrôlant des protéines kinases essentielles pour la progression mitotique. Les chercheurs avaient démontré que l’addition d’une molécule d’ubiquitine régule la fonction de ces enzymes cruciales et les relocalise dans des structures subcellulaires spécifiques. Toutefois, la manière exacte dont l’ajout d’ubiquitine régule la mitose ainsi que les mécanismes par lesquels ces signaux peuvent être décodés, demeurait inconnue.
En collaboration avec la plateforme de criblage haut-débit de l’institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, les chercheurs ont réalisé un criblage non biaisé, par ARN interférents, de tous les récepteurs protéiques connus et prédits de l’ubiquitine. Il existe environ 200 récepteurs de l’ubiquitine dans les cellules humaines qui peuvent spécifiquement reconnaitre des substrats ubiquitinés et moduler leur fonction. Cette analyse a permis l’identification de la protéine de liaison à l’ubiquitine appelée UBASH3B.
UBASH3B avait été précédemment montrée comme dérégulée dans des cancers humains mais n’avait jamais été reliée à la progression mitotique. Les chercheurs ont pu déterminer qu’UBASH3B est essentielle pour la ségrégation correcte des chromosomes pendant la mitose. De plus, UBASH3B interagit directement avec la forme ubiquitinée d’AURORA B, une des kinases les plus importantes régulant la ségrégation chromosomique lors de la mitose. Par cette interaction, UBASH3B contrôle la localisation subcellulaire d’AURORA B, sans modifier son niveau d’expression. UBASH3B est un facteur essentiel, à la fois requis mais également suffisant, pour induire le recrutement d’AURORA B sur les microtubules des fuseaux mitotiques qui régule la vitesse et la précision de la ségrégation chromosomique.
Cette étude identifie la première protéine réceptrice de l’ubiquitine mitotique dans les cellules humaines et montre de quelle manière le « code de l’ubiquitine » peut être déchiffré au cours de la division mitotique. Ces résultats peuvent aussi expliquer comment la dérégulation d’UBASH3B contribue au développement de nombreux cancers.

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Dépression : la piste inflammatoire se précise
25 février 2016

Certaines dépressions seraient liées à la suractivation de cellules immunitaires nommées mastocytes. C'est ce que suggère une récente étude menée sur des patients souffrant de mastocytose, une maladie rare. A la clef, de nouvelles pistes thérapeutiques pour les 30% de dépressifs résistants aux antidépresseurs actuels.
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Et  si certaines dépressions étaient liées à l'inflammation provoquée par des cellules de notre propre système immunitaire ? C'est ce que suggère une récente étude menée par Sophie Georgin-Lavialle dans les hôpitaux parisiens Necker et Sainte-Anne*, sur des adultes atteints de mastocytose, une maladie rare caractérisée par l'accumulation et l'auto-activation de cellules de notre immunité innée. Nommés mastocytes, ces derniers relarguent alors trop de molécules inflammatoires.

Mais pour étudier la dépression, pourquoi diable s'intéresser à une maladie ne provoquant le plus souvent que grattements, asthme et troubles digestifs ? Tout d'abord parce que de plus en plus d'études suspectent une piste inflammatoire dans la dépression... Mais surtout parce que près de 50% des patients atteints de mastocytose  souffrent justement de symptômes dépressifs !  De quoi intriguer des chercheurs  en quête de nouveaux mécanismes susceptibles d'expliquer cette maladie mentale. Car on est encore bien loin d'avoir tout compris... La preuve ? Près d'un tiers des 350 millions de personnes dépressives à travers le monde répondent mal aux antidépresseurs disponibles !

La synthèse de sérotonine détournée
Dans la pratique,  l'étude a porté sur 54 adultes atteints de mastocytose, comparés à 54 adultes sains de même profil (âge, sexe...). L'équipe a mesuré leurs éventuels troubles dépressifs, puis analysé leur sang. C'est ainsi que les chercheurs ont d'abord découvert que les plus dépressifs possédaient des concentrations sanguines plus faibles en tryptophane... Or de précédentes études suspectaient justement une perturbation  du métabolisme de cet acide aminé dans les dépressions possiblement induites par une inflammation. Dans le cerveau, le tryptophane est le précurseur métabolique de la sérotonine, un neurotransmetteur qui est la cible des antidépresseurs actuels, visant à augmenter la concentration de sérotonine dans le cerveau.

En suivant cette piste, l'équipe a ensuite découvert que ces malades atteints de mastocytose présentaient effectivement des taux sanguins plus faibles de sérotonine par rapport aux sujets sains... mais des taux plus élevés de dérivés neurotoxiques du tryptophane tel l'acide quinolinique. " Plutôt que de servir à la synthèse de sérotonine, la dégradation du tryptophane semble ainsi détournée pour produire ce type de composés neurotoxiques", analyse  Raphaël Gaillard (Sainte-Anne) qui a co-coordonné l'étude avec Olivier Hermine (Necker).

Les mastocytes en cause ?
Cette découverte ouvre de nouvelles pistes thérapeutiques pour les dépressifs réfractaires aux antidépresseurs actuels. Parmi elles, le recours à la kétamine, un anesthésiant doté d'une qualité qui tombe à pic : il bloque les effets de l'acide quinolinique. Menées sur des patients dépressifs, certaines études ont d'ailleurs déjà montré des effets antidépresseurs spectaculaires de la kétamine.
Deuxième grande piste : tester l'effet de molécules capables d'empêcher les mastocytes de relarguer leurs molécules inflammatoires. En effet, il se pourrait bien que ce phénomène soit celui qui déclenche le détournement de la synthèse de sérotonine... " Mais dans un premier temps, nous allons déterminer si les dépressifs réfractaires aux antidépresseurs actuels ont des mastocytes suractivés ", conclut Raphaël Gaillard.

Note
* Unité Inserm U894, Centre de Psychiatrie et Neurosciences, hôpital Sainte-Anne, Paris. Unité 1163 Inserm/université Paris-Descartes, Centre de référence des mastocytoses, Institut Imagine, hôpital Necker, Paris.
Source
S Georgin-Lavialle et coll., Mast cells' involvement in inflammation pathways linked to depression : evidence in mastocytosis, Molecular Psychiatry, doi:10.1038/mp.2015.216, 2016.

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Le zooplancton sous la menace du climat
Lise Barnéoud dans mensuel 460
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À quel point l'acidification des océans menace-t-elle les organismes qui y vivent ? En Arctique, la fragilité d'un petit escargot planctonique, situé à la base de la chaîne alimentaire, préoccupe les biologistes.
P ersonne, il y a encore quatre ans, ne s'intéressait à ces minuscules escargots qui nagent dans l'océan Arctique : les ptéropodes Limacina helicina. Ils semblaient en effet si nombreux, atteignant par endroits plusieurs milliers d'individus par mètre carré, que leur sort ne suscitait aucune inquiétude. Une bonne nouvelle, car ces animaux représentent jusqu'à 90 % de la biomasse de zooplancton en Arctique. Mais c'était sans compter avec l'acidification des océans, qui résulte de la dissolution dans l'eau de mer d'une partie du dioxyde de carbone CO2 atmosphérique : la coquille des ptéropodes est tout particulièrement sensible à ce phénomène.

En avril 2012, cela vaudra à ces animaux une place de choix lors de la présentation finale des résultats du Programme de recherche européen sur l'acidification des océans baptisé Epoca, selon son acronyme anglais, dédié à l'étude des conséquences de cette acidification lire « L'acidification des océans sous surveillance », p. 81. Car selon son coordinateur, Jean-Pierre Gattuso, du laboratoire d'océanographie de Villefranche-sur-Mer : « Cette espèce est celle sur laquelle nous avons observé le plus d'effets négatifs dus à l'acidification. Ce qui permet de la considérer comme une espèce sentinelle de ce phénomène. » Explications en avant-première.

Eaux de surface acides
Chaque jour, les océans absorbent environ 22 millions de tonnes de CO2 émis par les activités humaines. Cela permet d'atténuer l'augmentation de l'effet de serre, mais avec un dommage collatéral : l'acidification des eaux de surface. Ainsi, le CO2 se dissout dans l'eau en formant des ions bicarbonates accompagnés d'ions hydrogène acidifiants.

Résultat : depuis le début de la révolution industrielle, il y a deux cent cinquante ans, les eaux de surface s'acidifient. L'évolution de leur pH, l'unité de mesure de l'acidité, inversement corrélée à la concentration en ions hydrogène, le prouve. Entre la période préindustrielle et aujourd'hui, il est passé de 8,2 à 8,1. Ce qui, mine de rien, signifie une augmentation d'acidité de 30 % !

Le phénomène est d'autant plus inquiétant qu'il s'est accéléré ces vingt dernières années. Et tout indique qu'il ira en s'aggravant dans le futur : en fonction des différents scénarios sur les émissions humaines de CO2 élaborés par le Groupe d'experts intergouvernemental sur l'évolution du climat GIEC, le pH des eaux de surface pourrait diminuer de 0,3 à 0,5 unité d'ici à la fin du siècle. « Cela équivaut à une augmentation de l'acidité allant de 90 % à 150 % pour 2100 », précise Jean-Pierre Gattuso.

Pas de chance pour lui, Limacina helicina vit au mauvais endroit avec la mauvaise coquille. Au mauvais endroit, l'océan Arctique, car l'acidification est beaucoup plus marquée dans les hautes latitudes. La dissolution du CO2, comme de tout autre gaz, est en effet favorisée par les basses températures. Si l'augmentation du CO2 atmosphérique continue au rythme actuel, l'acidité de cet océan pourrait, d'ici à cent ans, augmenter de 185 % [1] .

Avec la mauvaise coquille, car elle est constituée d'aragonite, une forme de calcaire plus sensible à l'acidification que la calcite produite par la majorité des autres organismes marins calcificateurs. Or, on estime que, dès 2050, la moitié de la superficie de l'océan Arctique dissoudra l'aragonite. Voilà pourquoi, il y a quatre ans, Limacina helicina a éveillé la curiosité des spécialistes de l'acidification.

Lorsque, en 2007, Steeve Comeau commence sa thèse au laboratoire d'océanographie de Villefranche-sur-Mer, les ptéropodes Limacina helicina n'ont pratiquement fait l'objet d'aucune étude. « C'était un challenge que de vouloir les étudier, car ils sont très fragiles », raconte le biologiste, aujourd'hui à l'université d'État de Californie, à Northridge. Deux années de suite, il se rend au Svalbard, archipel norvégien situé à la limite de l'océan Arctique. Là, à la fin du printemps, les ptéropodes viennent par milliers à la surface des eaux, pour se reproduire. Un simple filet à plancton permet d'en récolter des dizaines. Ils sont ensuite déposés dans des aquariums de 20 litres remplis d'eau de mer. « S'ils touchent le fond de l'aquarium, ils peuvent se casser, précise Steeve Comeau. Il faut donc créer un courant ou travailler dans de grands volumes pour éviter qu'ils ne touchent les parois. »

Contrainte supplémentaire, il est impossible de les faire se reproduire en laboratoire, et ceux pêchés en mer ne vivent pas plus de trois semaines. En pratique, il faut donc se contenter de ce court laps de temps pour augmenter artificiellement la quantité de CO2 atmosphérique et faire varier la température de l'eau, selon les différents scénarios du GIEC.

Moins de coquille
En théorie, l'acidification peut avoir deux effets sur la coquille : la dissoudre, ou ralentir sa synthèse car elle diminue la concentration d'ions carbonates, utilisés par les organismes calcificateurs pour édifier leur structure. Or, les expériences réalisées dans le cadre d'Epoca montrent que les ptéropodes soumis à une acidification fabriquent moins de coquille que les animaux maintenus dans les conditions actuelles, et que cette coquille se dégrade plus vite, quel que soit le scénario du GIEC. Sachant que la coquille sert de protection contre les prédateurs, « sans elle, je ne donne pas cher de leur peau dans l'océan », conclut Jean-Pierre Gattuso.

Certes, pour une même concentration de CO2, une augmentation de température atténue les effets de l'acidification. Ainsi, pour une concentration de CO2 fixée au double de la concentration actuelle, les animaux continuent de fabriquer leurs coquilles lorsque l'eau est à 4 °C, alors qu'ils n'y parviennent pas si elle est à 0 °C. Cette différence vient du fait que, pour une même concentration en CO2, la concentration en ions carbonate est plus importante lorsque la température de l'eau est élevée. Mais cet effet a des limites : lorsque la concentration de CO2 est trois fois supérieure à l'actuelle le scénario le plus pessimiste du GIEC pour 2100, la calcification est inhibée, quelle que soit la température [2] .

Juvéniles menacés .
Enfin, ultime mauvaise nouvelle, les juvéniles semblent particulièrement menacés : pour une concentration de CO2 correspondant au scénario le plus pessimiste du GIEC, la dégradation de leurs coquilles augmente de 40 % [3] . Cette donnée est d'autant plus préoccupante que, l'hiver, ils cessent de fabriquer leurs coquilles. « Leur seule réponse possible face à l'acidification est donc la dissolution », prédit Silke Lischka, de l'institut Leibniz en Allemagne, qui a mené ces expériences.

Bien sûr, l'augmentation naturelle de l'acidification en Arctique sera moins rapide que celle réalisée en aquarium. Est-il dès lors envisageable que les ptéropodes aient le temps de s'adapter ? « Il est possible qu'ils se mettent à fabriquer plus de coquille pour minimiser les dégâts, suppose Silke Lischka. Mais le coût énergétique que cela représente pèsera sur leur développement ou leur reproduction. »

Et cela, même si le réchauffement climatique et la fonte de la banquise stimulent la croissance de certaines algues dont ils se nourrissent. Certes, il s'agit d'une augmentation des ressources énergétiques disponibles. Mais le problème est qu'elle se produira surtout au printemps et durant l'été. « Or, les expériences montrent que c'est en hiver que l'acidification affectera d'abord les juvéniles. Soit une période de l'année où l'eau reste très pauvre en nutriments sous la banquise », objecte Steeve Comeau.

Pour en avoir le coeur net, l'idéal serait de réaliser des expériences in situ sur de plus longues périodes, dans des enceintes étanches plongées dans la mer. Mais jusqu'à présent, les tentatives en ce sens ont échoué. Mystérieusement, aucun ptéropode n'a survécu dans ces conditions « naturelles »...

Quoi qu'il en soit, une chose est sûre : le processus d'acidification est enclenché, et la survie de ces gastéropodes arctiques semble bel et bien menacée. De quoi provoquer des réactions en chaîne dramatiques dans l'écosystème marin, puisque ces animaux constituent une source incontournable de nourriture pour les saumons, les harengs, les baleines, et de nombreux oiseaux marins.
[1] M. Steinacher et al., Biogeosciences, 6, 515, 2009.

[2] S. Comeau et al., PlosOne, 5, 6, 2010.

[3] S. Lischka et al., Biogeosciences, 8, 919, 2011.
L'ESSENTIEL
- DE MINUSCULES escargots, les ptéropodes arctiques, représentent jusqu'à 90 % de la biomasse de zooplancton en Arctique.

- LEURS COQUILLES, constituées d'aragonite, sont très sensibles à l'acidification des eaux de surface.

- LE PROGRAMME européen Epoca, qui se termine en avril 2012, indique que leur disparition est presque inéluctable. Elle pourrait mettre en danger tous les animaux saumons, harengs, baleines, oiseaux marins qui s'en nourrissent.
L'ACIDIFICATION DES OCÉANS SOUS SURVEILLANCE
Le projet européen Epoca, coordonné par le laboratoire d'océanographie du CNRS à Villefranche-sur-Mer, a été lancé en mai 2008 pour étudier les conséquences biologiques, écologiques et sociales de l'acidification des océans associée à l'émission de dioxyde de carbone par l'homme. Il rendra ses conclusions en avril 2012. Les 160 chercheurs impliqués originaires de dix pays européens se sont intéressés aux changements de la chimie des océans et à la réponse biologique des organismes. Quels sont les seuils d'acidité au-delà desquels les écosystèmes seraient transformés de façon irréversible ? Quelles réductions des émissions de dioxyde de carbone seraient nécessaires pour de pas dépasser ces seuils ? Ils ont aussi réalisé des projections sur les évolutions probables de la situation d'ici à 2100.
UN LABORATOIRE NATUREL EN MÉDITERRANÉE
Au nord du golfe de Naples, les fuites sous-marines de dioxyde de carbone dues à l'activité volcanique du Vésuve augmentent l'acidité de la Méditerranée jusqu'aux niveaux prévus globalement pour 2100. Aussi l'une des expériences du programme Epoca a-t-elle consisté à transplanter sur ce site des coraux, des patelles et des moules ci-dessous, puis à étudier le taux de calcification et de dissolution de leurs coquilles. Résultat : la dissolution augmente, mais la calcification se maintient, et parfois même augmente, sauf lorsque la température monte, comme c'est le cas à la fin de l'été. Cette élévation de la température entraîne un arrêt de la calcification, et une augmentation de la mortalité d'autant plus élevée que l'acidité est forte. « Cela s'explique probablement par le fait que ces animaux méditerranéens vivent déjà à leur limite supérieure de tolérance pour la température. Un petit degré de plus, et leur seuil létal est atteint » , explique Jean-Pierre Gattuso, coordinateur d'Epoca. R. Rodolfo-Metalpa et al., Nature Climate Change, 1, 308, 2011.
SAVOIR
www.epoca-project.eu Le site web du projet Epoca.

Denis Allemand, Stéphanie Reynaud et Bernard Salvat, « Un monde trop acide pour les récifs coralliens », La Recherche, septembre 2010, p 56.

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VOIR LES CELLULES COMMUNIQUER

Nos cellules "communiquent" chimiquement en échangeant des "molécules-mots" : hormones, neurotransmetteurs, etc. Le dialogue entre neurones dans notre cerveau est ainsi intimement lié à leurs échanges de petites bouffées de neurotransmetteurs de proche à proche. Beaucoup est déjà connu en physiologie et en biologie sur ce domaine, mais il reste encore très mystérieux car nos connaissances sur le sujet sont encore limitées par des difficultés expérimentales. Cela se comprend aisément lorsque l'on sait que ces échanges impliquent seulement quelques milliers de molécules-mots en quelques millièmes de seconde. De même, les neurones étant incapables de stocker leur énergie, ont une activité impliquant un couplage très fin avec le système neurovasculaire qui irrigue le cerveau. En d'autres termes, lorsqu'un neurone "communique avec ses partenaires", il doit simultanément "réclamer" un accroissement du flux sanguin à son voisinage immédiat. C'est précisément cette modulation locale du flux sanguin qui est observée en temps réel par imagerie IRM ou par caméra à positons (PET scan) avec des conséquences importantes en médecine ou en sciences cognitives. Néanmoins, le phénomène observé n'est que le résultat d'un échange de neurotransmetteur, le NO, sous-jacent comme nous le démontrerons au cours de cette conférence. Au cours de cette conférence nous expliquerons comment des électrodes extrêmement petites (entre une vingtaine et une cinquantaine d'entre elles, réunies en faisceau, auraient l'épaisseur d'un seul cheveu humain !) peuvent être utilisées afin de "voir les cellules parler". Nous montrerons ensuite comment les données expérimentales ainsi obtenues permettent de remonter aux mécanismes physicochimiques mis en jeu, c'est-à-dire de "comprendre comment elles parlent". voir le site internet : : http://helene.ens.fr/w3amatore/

Voir les cellules communiquer
Conférence donnée par Christian AMATORE
Professeur UPMC-ENS,
Directeur du Département de Chimie de l’Ecole Normale Supérieure de Paris
Directeur de Recherche au CNRS et Membre de l’Académie des Sciences
Parler de la communication cellulaire c’est évoquer la présence de neurones qui sont les
principales cellules du système nerveux. Grâce à de nombreux bras, ils sont connectés entre eux
formant un véritable réseau de « câbles ».
Chaque neurone est composé d’un corps ainsi que deux types de ramifications: les dendrites
par lesquelles l’information entre dans le neurone et les axones qui assurent sa sortie. Le corps du
neurone traite et filtre l’information reçue avant de la transmettre aux autres neurones. Cette
transmission est assurée par la présence de neurotransmetteurs contenus dans des vésicules
formées dans le corps du neurone mais qui s’accrochent sur des rails tubulaires par des moteurs
moléculaires qui vont transporter ces vésicules à l’autre extrémité de l’axone car les distances
sont trop longues pour que les vésicules puissent aller par simple diffusion. Arrivées à l’extrémité
du bouton synaptique, elles peuvent fusionner avec la membrane du neurone et vider leur contenu
dans l’espace synaptique. Les neurotransmetteurs libérés vont traverser par diffusion l’espace
synaptique d’épaisseur d’environ 20 nm et arriver au voisinage d’un détecteur, ce qui va
déclencher le signal dans le second neurone : D’où le processus de la transmission de
l’information.
Dans le présent exposé, il ne s’agit pas décrire le neurone, qui a été largement examiné dans
la littérature à travers les travaux des biologistes mais plutôt de comprendre comment se fait la
fusion au moyen des techniques physico-chimiques.
Pour ce faire, une première idée de base se trouve dans la littérature et surtout dans les travaux de
Almers [1] fondés sur la spectroscopie.
Dans ces travaux, Almers a marqué les vésicules par des sondes fluorescentes afin de suivre
le déplacement des vésicules dans les cellules chromaffines. Le faisceau lumineux utilisé pour
l’excitation est une onde évanescente qui se propage sur environ 50 nm d’épaisseur et «éclaire »
seulement le voisinage de la membrane. En effet, quand la vésicule est en dehors du champ du
faisceau, ses sondes fluorescentes ne peuvent pas être « allumées » et ne donnent donc pas
d’images sur la caméra microscopique. Au contraire, dès qu’une vésicule arrive au voisinage de
la membrane, elle entre dans le champ du faisceau et plus elle est proche de la membrane, plus sa
luminosité est élevée. Quand elle fusionne avec la membrane cellulaire, elle éjecte sa propre
membrane dans la membrane cellulaire, et donc l’ensemble de ses sondes fluorescentes va
s’éclairer plus puissamment (figure 1a).
Figure 1 : Mise en évidence de la fusion des vésicules par fluorescence
En effectuant un calcul simple, on se rend compte que la quantité de membrane donnée par
la vésicule à la membrane cellulaire est proportionnelle à la quantité de sondes fluorescentes qui a
été apportée par la vésicule. Si on intègre la partie éclairée (lumière verte) de chacune des images
(figure 1b), on obtient une courbe montrant la quantité de membrane qui s’écoule de la vésicule
dans celle de la cellule (figure 1b). Néanmoins la mesure du signal, pour être précieuse, est
extrêmement mauvaise car la marge d’erreur est trop importante pour en tirer des conséquences
cinétiques.
Nous avons réalisé une série de mesures électrochimiques [2] sur des cellules chromaffines
de boeuf qui conduisent à la libération d’adrénaline chez les mammifères. Ces cellules peuvent
être stimulées à l’aide d’une pipette par l’injection d’une solution saline d’ions baryum ou
calcium au voisinage de la cellule ce qui joue le rôle de la stimulation dans l’organisme (figure
2). Suite à cette stimulation, la cellule répond en émettant des molécules de neurotransmetteurs.
Ces molécules seront détectées en plaçant une électrode au dessus de la cellule. Ces électrodes
sont de taille micrométriques (7 μm), bien plus petites qu’un cheveu et isolées tout au long de
leur longueur ; seule leur extrémité est active [3].
Figure 2 : Configuration du modèle de la synapse artificielle
L’exploitation de la méthode électrochimique s’explique par le simple fait que les
molécules émises sont facilement oxydables par voie électrochimique à la surface de l’électrode
du fait de la présence de leur noyau catéchol qui évolue en noyau quinone suite à un transfert de 2
électrons.
Ainsi, à chaque fois qu’une molécule est libérée par la cellule, autrement à chaque fois qu’il
y a fusion d’une vésicule avec la membrane cellulaire, la molécule arrive par diffusion au
voisinage de l’électrode, et après échange de 2 électrons provoque un courant électrique: le
courant se définit comme étant le nombre d’électrons échangés par unité de temps, soit la moitié
du nombre de molécules d’adrénaline libérées par la cellule. Un tel dispositif est appelé « synapse
artificielle ».
Si on examine de près un neurone, on s’aperçoit que durant son fonctionnement, c'est-à-dire
au cours de la transmission de l’information, il envoie en moyenne 5000 à 7000
neurotransmetteurs dans l’espace synaptique; une telle quantité de molécules, surtout des
molécules de petites tailles ne peut pas être observée de manière quantitative malgré la précision
des méthodes analytiques actuelles cependant le neurone y parvient.
En réalité, le problème qui se pose avec cette si faible quantité de molécules émises (5000
molécules) est qu’elle ne produira pas un signal utilisable. En effet, un autre paramètre aussi
important contrôle la réponse surtout pour un nombre aussi peu élevé de molécules émises: il
s’agit du bruit. En d’autre terme, l’intensité du signal observé dépend du rapport signal/bruit et
pas simplement la valeur du signal lui-même.
Pourquoi donc avec un nombre aussi peu élevé de molécules émises, le neurone arrive à
contrôler ce bruit et permet la transmission sans encombre de l’information?
La réponse est toute simple car le neurone ne fonctionne pas en terme de quantité de
molécules mais plutôt en terme de cinétique, autrement dit est fonction de la probabilité que la
molécule libérée touche le détecteur (c’est à dire l’électrode dans la configuration que nous
utilisons).
Ainsi, pour un volume donné, plus on a de molécules plus la probabilité que le détecteur
soit atteint est élevée. Donc, en présence d’un nombre très limité de molécules comme ici, il
suffit de les forcer à se distribuer dans un petit film liquide afin d’accroître la probabilité que ces
molécules touchent le détecteur.
Pour ce faire, nous avons développé avec l’équipe du Professeur Wightman [2], une
méthode dans laquelle un mince film de liquide est présent entre la cellule et l’électrode. C’est
dans ce film mince que toutes les molécules émises seront observées comme dans le cas du
neurone. Lorsqu’on stimule la cellule par l’injection d’une solution adéquate à l’aide de la
pipette, on enregistre ainsi une série de pics, chaque pic résulte de la fusion entre une vésicule et
la membrane cellulaire (figure 2). Chaque réponse vésiculaire est représentée par la variation du
courant en fonction du temps. Elle contient l’information relative à la fusion de la vésicule avec
la membrane et dans cette étude, on atteint une résolution de 1000 molécules par millième de
seconde, résolution que l’on ne peut obtenir avec les autres instruments actuels même les plus
sensibles pour des molécules de ce type et dans les conditions imposées par le vivant. Nous ne
pouvons atteindre une telle résolution que parce que nous suivons un phénomène cinétique, c'està-
dire une vitesse de transfert d’électrons (flux de molécules) convertie en un courant grâce à une
électrode.
Les biologistes résument généralement la fusion en trois étapes mais si on représente plus
schématiquement, ce processus fait intervenir les 5 étapes illustrées sur la figure suivante:
Figure 3 : Représentation des différentes étapes de la fusion des vésicules
La première étape « 0 » correspond à l’approche de la vésicule vers la membrane cellulaire.
Lorsque la vésicule atteint la membrane cellulaire, « étape I », il se crée un pore de fusion à
travers lequel des molécules vont commencer à sortir. Les biologistes parlent ici d’accostage et
de création d’un pore de fusion. Les étapes II à IV correspondent à l’ouverture des pores jusqu’à
moment où la vésicule termine sa vie en dehors de la membrane. On parle ici de fusion totale.
D’un point de vue électrochimique, chacun des pics de la réponse ampérométrique obtenue
précédemment aura une résolution qui correspond au flux de molécules qui sont relâchées. Ainsi,
dans l’étape 0, vu qu’aucune molécule n’est émise le courant i est alors nul. Lors de la création
du pore de fusion, on démontre à partir d’une loi de physico-chimie classique que le courant
correspond à un plateau. Au moment où la membrane craque et la fusion totale débute (II), la
quantité de particules croît rapidement car la vésicule expose de plus en plus de sa surface au
milieu extérieur. Cela se poursuit jusqu’au moment où la vésicule est totalement exposée et
continue à se vider et le courant redescend donc. D’après cette représentation physico-chimique,
on observe plusieurs évènements et on se rend compte que ces courbes sont complémentaires de
celles obtenues par Almers où l’utilisation des sondes fluorescentes permettait de suivre la
membrane de la vésicule « couler » dans la membrane cellulaire. Autrement ces deux expériences
sont liées non pas par leur principe de mesure mais par le phénomène.
Pour approfondir notre étude, examinons de près ce qui se passe réellement au niveau de la
membrane cellulaire.
Il est bien connu que la membrane cellulaire ainsi que la membrane des vésicules portent
énormément de charge négative en surface. Comment se fait-il donc que ces deux membranes ne
se repoussent pas ?
La vésicule arrive à s’accrocher à la membrane cellulaire à cause des complexes de
protéines formés lorsque les ions calcium rentrent dans la cellule. Ces ions jouent en quelque
sorte le même rôle que les bases dans l’ADN et vont permettre au système de protéines de se lier
fortement en s’enroulant en hélice et générer ainsi une pression telle que la vésicule viendra au
contact de la membrane cellulaire bien que par elle-même, elle ne le pourrait pas. Ce mécanisme
a été confirmé en bloquant ce phénomène par l’injection d’une toxine, la botox des chirurgiens
plastiques, à laquelle est accrochée une protéine connue sous le nom de GFP (Green Fluorescent
Protein) qui rend la cellule modifiée fluorescente. Les résultats obtenus sur les cellules ainsi
modifiées confortent cette hypothèse car si en absence de la toxine, on obtient une forêt de pic, en
ajoutant la toxine, le nombre d’évènements observé en fonction du temps diminue
considérablement.
L’appareillage protéinique est donc indispensable mais pas autant que l’on raconte ; il est juste
nécessaire pour « démarrer » le système mais le système évolue par la suite purement physico
chimiquement.
Pour consolider ce raisonnement, étudions de près le phénomène à l’interface des deux
membranes : celle de la cellule et celle de la vésicule. Etant donné que la vésicule a une taille de
150 nm, on peut négliger la courbure entre les deux membranes et décrire uniquement le
phénomène dans une tranche horizontale.
Lorsqu’elles s’approchent, la pression exercée est telle que les membranes vont être forcées
de repousser la répulsion électrostatique des charges négatives en éliminant latéralement leurs
deux plans en regard et en joignant les bords des deux « trous » crées. Ces deux extrémités
s’étirent et forment une membrane bicouche au centre (figure 4) qui sous la contrainte de
pression, finira par se casser pour former le pore de fusion à partir duquel les molécules vont
commencer à sortir. Ce comportement peut se confirmer aisément en étudiant la stabilité d’un
pore à partir de la théorie décrite par de Gennes et Brochard. Cette théorie stipule que l’énergie
W du pore est donnée par la relation suivante :
W = W1 + W2
L’énergie W1 est positive. Elle est liée à la tension du bord car les lipides qui s’y trouvent
sont « mécontents » de faire partie du bord du pore. Cette énergie est alors proportionnelle au
nombre de lipides présents autour du bord, c'est-à-dire au périmètre du bord et aura tendance à
refermer le pore [3]:
W1 = 2πRρ,
où ρ est une constante et R le rayon du pore.
D’un autre côté, la pression qui règne à l’intérieur de la vésicule a tendance à écarter le pore
pour relâcher la pression intérieure et engendrera par conséquent une énergie négative
proportionnelle à la surface du pore :
W2 = - σπR2
où σ est une autre constante.
Figure 4 : Mécanisme de la formation du pore de fusion
La forme plate des membranes cellulaires est due au fait que les lipides constituants ces
membranes cellulaires se présentent sous formes de petits cylindres adjacents comme des
bâtonnets. Ces structures peuvent être rompues si la configuration de ces lipides est modifiée.
Ainsi, en injectant des lipides de configurations coniques où la chaîne hydrophobe est beaucoup
plus petite que la tête polaire, la forme conique aura tendance à faire courber la membrane vers le
haut. Par contre, si la chaîne hydrophobe des lipides est très grosse par rapport à la tête polaire,
une courbure se fera dans l’autre sens.
Dans la pratique, si l’on insère dans la membrane du Lysophosphatidyl Choline LPC, un
lipide dont la partie hydrophobe est linéaire et petite par rapport à la tête polaire, on constate que
le nombre d’évènements par unité de temps augmente comparativement aux contrôles. Toutefois,
lorsque le lipide utilisé à une structure telle que la chaîne linéaire est plus large que la tête polaire,
cas de l’Acide Arachidonique symbolisé par AA, le nombre d’évènements observés diminue.
L’un et l’autre phénomène illustrent donc l’impertinence de ces courbures locales sur la
possibilité de fusionner.
Durant l’ouverture du pore, les molécules de la matrice vésiculaire vont diffuser et sortir par
ce pore. Si le pore est suffisamment large, seule la vitesse à laquelle les molécules trouvent la
sortie contrôlera le temps de sortie. En exploitant une loi de physico-chimie donnée par la
relation suivante:
i = 4nFDgranuleCgranuleRpore
et connaissant les paramètres n, F, Dgranule et Cgranule de cette relation, on peut relier directement
le rayon du pore R à l’intensité du courant i dû au pore c’est à dire au flux de molécules par la
relation simplifiée suivante.
Rpore/ nm = 0,3 x ifoot/ nA
A partir de la hauteur de chaque petit plateau précédent le pic, on montre ainsi que la taille
du pore est de l’ordre de (15,0 ± 0,5) nm.
La valeur élevée de la marge d’erreur signifie que l’on n’a pas affaire à un assemblage biologique
tu type protéique qui lui devrait donner une valeur très constante. La grande variabilité de la taille
du pore n’est en effet pas due à une erreur de mesure mais plutôt au fait que la taille du canal
change fortement d’un évènement à l’autre, à travers une fourchette assez grande. Ce résultat est
tout à fait compatible avec un canal lipidique qui, en fonction de la tension lipidique sera plus ou
moins grand.
Mais comment est-ce que le pore craque ?
Pour répondre à cette question, on rappelle le modèle de Gennes et Brochard où une des
énergies est proportionnelle à la tension surfacique et l’autre au diamètre du pore. La variation de
l’énergie en fonction de la taille du pore montre que l’énergie se présente ainsi sous la forme
d’une courbe présentant un minimum suivi d’un maximum correspondant à un rayon de pore
élevé et une haute énergie. Le pore se stabilise donc spontanément au niveau du minimum
d’énergie, et pour que le pore craque, il faudrait que le rayon devienne plus grand que la taille
correspondant au maximum d’énergie. Cela est quasiment impossible car la cellule ne dispose
pas suffisamment d’énergie.
Une façon de procéder consiste à augmenter la valeur du paramètre σ intervenant dans W2.
Ceci a pour conséquence de faire croître la partie parabolique (W2) et donc à diminuer la distance
radiale entre le minimum et le maximum d’énergie de façon à ce que le pore devienne instable. Il
finira par exploser lorsque les deux points seront confondus. L’augmentation de ce paramètre
σ, autrement de la pression, provient de l’intérieur de la matrice qui va gonfler en contact de
l’espace synaptique « comme les gels à raser » et créer une force de pression à l’intérieur de la
vésicule.
La compréhension de tous ces phénomènes nous permet de nous rendre compte que
l’évolution de chaque pic est lié à deux paramètres : d’une part une courbe positive croissante
linéairement liée au bord du pore et d’autre part une courbe négative décroissante
symboliquement correspondant à la surface du pore. C’est ce conflit entre R et R2 que la nature
exploite pour conduire le pore à une situation métastable où il n’a d’autre issu que de croître
quasi-exponentiellement, faisant ainsi fusionner totalement les deux membranes. C’est ainsi que
débute la phase de fusion complète qui va conduire à la forme caractéristique du pic de courant
observé expérimentalement.
En effet, le courant, c'est-à-dire le flux de molécules relâché pendant l’étape de fusion totale
dépend de deux facteurs. L’un est la diffusion des molécules. Celui-ci à tendance à diminuer avec
le temps car les molécules émises doivent traverser de plus en plus de matrice avant de se trouver
sur la surface de la vésicule et de diffuser librement vers l’électrode.
L’autre phénomène est lié à la vitesse de fusion des membranes. En effet, la fusion entraîne
un accroissement de la surface de matrice exposée à la solution par laquelle les molécules
peuvent quitter la matrice. Le pore augmentant de taille, la surface exposée varie de 0%
initialement jusqu’à 100% de la surface de la vésicule à la fin du processus de fusion. Partout,
cela conduit à accroître le courant puisque celui-ci traduit le flux de molécules libérées.
La vitesse de diffusion est parfaitement connue. Par un processus mathématique, on pourra
donc soustraire de la courbe réelle, la composante de diffusion et reconstituer la cinétique de la
courbe d’ouverture. La figure 5 représente les résultats obtenus et on s’aperçoit très bien que ces
courbes d’ouverture, obtenues par ampérométrie sont en pratique comparables à celles décrites
plus haut par l’utilisation des sondes fluorescentes. Cependant, la précision de nos mesures est
bien meilleure à celle obtenue par la méthode d’Almers. Cela nous permet de fait de réaliser avec
une bonne approximation des mesures quantitatives des vitesses de fusion des deux membranes et
d’étudier très précisément ce qui se passe.
Figure 5 : Cinétique de la fusion totale obtenue par ampérométrie
De plus, la combinaison de ces deux expériences (les méthodes spectroscopiques décrites
par Almers et les mesures ampérométriques que nous avons développées) nous donne une
assurance sur la validité de nos expériences. Nous sommes d’ailleurs en train de développer au
sein de notre équipe grâce aux techniques de microfabrication, un dispositif nous permettant de
suivre une cellule isolée dans une zone éclairée [4]. Avec un tel dispositif, nous avons déjà
montré qu’il est possible d’avoir simultanément une information correspondant à la mesure
physico-chimique à l’aide de l’électrode transparente située en dessous de la cellule et de voir
simultanément ce qui se passe au niveau de la cellule.
De ces différents résultas obtenus, on voit l’intérêt des modèles mathématiques car ils nous
permettent de savoir exactement ce qui se passe. Comme on vient de voir, notre phénomène est
contrôlé par deux paramètres dont la pression qui se traduit par le paramètre σ mais aussi par la
vitesse à laquelle l’énergie peut-être relâchée. En effet, le problème qui se pose à ce stade est de
pouvoir dissiper l’énergie due au relâchement de la pression intravésiculaire pendant qu’elle se
produit. Pour ce faire, au moment de l’ouverture, la membrane d’au dessus glisse sur celle d’en
dessous, ce qui crée une dissipation d’énergie par la viscosité entre les deux membranes. Si la
viscosité est grande, elle ralentit la vitesse à laquelle le pore peut s’ouvrir et se traduira par un
faible mouvement d’ouverture. Dans ce cas, la courbe d’ouverture s’affaisse alors que celle de la
diffusion reste la même et par conséquent le pic de courant devient petit et très large. Dans le cas
contraire, si cette pression augmente, c'est-à-dire que la viscosité est diminuée, la fonction
d’ouverture croît rapidement et comme la diffusion est toujours identique, la combinaison des
deux courbes conduit à un pic fin et haut. La variation de la viscosité entre les deux membranes
est due à l’existence de forces de frottements exercées lors du glissement. Pour augmenter
davantage cette viscosité, il suffit de plier davantage la membrane en réalisant un choc
osmotique. Ainsi, en mettant à l’extérieur une solution trop saline, la cellule réagit en éjectant son
eau vers l’extérieur pour s’équilibrer avec la solution extérieure ; ce faisant elle diminue son
volume alors que sa membrane reste la même et comme la nature a horreur du vide, elle va
plisser sa membrane, la cellule devenant ainsi très « ridée ». On constate alors que par rapport
aux cellules normales, il n’y a presque plus d’évènements. Si on examine de plus près, on se rend
compte qu’il y a des pics mais ils sont très petits et très larges et se confondent au bruit. Par
contre, dès qu’on remplace la solution extérieure par une solution normale, la cellule redevient
tendue et reprend un régime de libération normale. Au contraire, en rigidifiant la membrane en
injectant une solution peu saline, la cellule absorbe l’eau de l’extérieur et comme son volume n’a
pas changé, elle va tendre sa membrane et là on constate que le nombre d’évènements va
considérablement augmenter.
Ce que nous venons de montrer illustre parfaitement le rôle des modèles en science. D’une
part, ils permettent de comprendre les facteurs indépendants qui contrôlent un phénomène
physique chimique mais aussi biologique, et de montrer comment la complexité d’un phénomène
globale peut-être liée à leurs interactions. C’est la partie explicative de la science. D’autre part, et
c’est aussi leur fonction, ils permettent de prédire ce qui va se passer dans telle ou telle condition
pourvu qu’ils restent valides. C’est la partie utilisatrice de la science qui conduit à la technologie.
Les deux fonctions sont connexes et intriquées mais diffèrent par leurs buts propres.
Au cours de la deuxième partie de cet exposé, je vais essayer d’illustrer comment la nature
peut mettre en place un processus technologique complexe, cette fois-ci non plus à l’échelle de la
cellule mais à celle du tissu.
Le couplage entre activité neuronale et la vasodilatation des capillaires sanguins dans le
cerveau.
Nous savons que les neurones sont des cellules délicates consommant énormément
d’énergie puisqu’on considère que notre cerveau utilise 25% de l’énergie qu’un être humain
produit quotidiennement. Or les neurones ne savent pas stocker cette énergie ni gérer les déchets
qu’ils produisent. Il en résulte que nos neurones actifs doivent être irrigués par un flux sanguin
plus important. C’est en effet notre sang qui amène l’oxygène, le glucose, etc., et élimine le gaz
carbonique et les autres déchets produits par une cellule en fonctionnement. On conçoit donc que
l’activité d’une zone du cerveau doive se traduire par une augmentation locale du flux sanguin.
C’est précisément ce qui est observé en imagerie IRM ou en camera à positons (PET Scan) avec
des conséquences importantes en médecine ou en sciences cognitives.
L’accroissement du flux sanguins est dû aux neurones eux-mêmes. Quand ils travaillent ils
ont besoin d’être alimenté en continu. Ainsi, lorsque la quantité de sang augmente, la pression
croît avec des risques que les neurones implosent. Toutefois, la pression globale dans le cerveau
est maintenue constante et ceci par le fait que la quantité de sang qui rentre est pratiquement
identique à celle qui en sort.
Si on observe bien une image IRM du cerveau, on voit principalement deux couleurs
distinctes : la partie « rouge » qui correspond à la partie en activité qui reçoit du sang et les
parties inactives qui sont colorées en « bleu » d’où la même quantité de sang est retirée. Comment
se fait ce mécanisme ?
Il est implicitement admis que lorsque les neurones fonctionnent (bouffées de
neurotransmetteurs en rouge), ils envoient des messagers représentés en vert, au voisinage des
vaisseaux sanguins pour entraîner leur dilatation (figure 6). En biologie, il est connu que l’espèce
responsable de cette dilatation est l’oxyde nitrique NO. En effet, quand du monoxyde d’azote NO
atteint le vaisseau, il se produit une cascade de réaction qui se traduit par une augmentation de la
taille des cellules des muscles lisses constituants l’armature du vaisseau sanguin et cette
augmentation engendre l’accroissement de la taille du trou à l’intérieur du vaisseau, le lumen par
lequel les globules rouges circulent.
Le monoxyde d’azote NO est produit à partir de la L-Arginine par la NO synthase, une
protéine assemblée sous forme de dimère grâce aux calciums qui encore une fois permettent une
régulation fine. Le mécanisme de fonctionnement du NO synthase est résumé sur le schéma 1:

Dans cette étude, effectuée en collaboration avec l’équipe du professeur Jean Rossier de
l’ESPCI, nous avons suivi à partir des mesures de physico-chimie le processus de vasodilatation
créé par un neurone étoilé en nous fondant sur l’étude d’une coupe dans le cervelet d’un rat.
A partir de l’image réelle vue au microscope (figure 6), on observe suite à la stimulation réalisée
par accrochage et stimulation du neurone par une pipette dite de patch-clamp, le vaisseau se
dilate puis se referme à l’issue de la stimulation. La formation du monoxyde d’azote NO a été
mise en évidence par des mesures ampérométriques en insérant dans la tranche de cerveau, une
microélectrode. Ces électrodes ont été préalablement calibrées par des ajouts successifs de NO.
En stimulant par la pipette patch-clamp le neurone étoilé, on constate une augmentation de
la quantité de NO détectée par l’électrode, puis lorsqu’on arrête la stimulation, cette quantité
diminue. Nos mesures indiquent que les quantités de NO libérées sont énormes c'est-à-dire près
de 100 fois la quantité physiologique de base en NO! Toutefois, en bloquant le système par
l’injection de substances inhibitrices des pompes sodiques et calciques et par la même désactivant
la NO synthase ou en utilisant un inhibiteur de la L-arginine, on n’observe aucune réponse à
l’électrode (figure 7) ni aucune dilatation locale du capillaire sanguin présent au voisinage du
neurone stimulé. Ces résultats confirment la formation du monoxyde d’azote NO.
Figure 7 : Mesures simultanées du NO produite et du diamètre du vaisseau après simulation par
patch-clamp
Par ailleurs, grâce aux appareillages de l’équipe du professeur Rossier, il nous est possible
de mesurer simultanément la dilatation du vaisseau (figure 7) et on s’aperçoit qu’avant la
stimulation, le diamètre du vaisseau reste presque constant tandis que dès que du NO atteint le
vaisseau, il se dilate puis revient à sa valeur initiale dès que le NO décroît.
Les mêmes conclusions peuvent être obtenues par modélisation et les calculs théoriques
effectués montrent d’une part que les quantités de NO émises sont énormes (100 fois plus au
minimum par rapport au régime normal) et d’autre part que lors du fonctionnement du neurone,
il y a activation des vaisseaux sanguins situés uniquement sur un rayon d’une dizaine de microns.
J’espère vous avoir montré à travers cet exposé tout l’intérêt d’une part de briser les
structures classiques de la science en se moquant de la nature physique, chimique, physicochimique
ou biologique d’un phénomène, mais en se focalisant sur tous les moyes en notre
possession pour en révéler leurs mécanismes intimes. D’autre part, je crois avoir illustré le fait
que les modèles scientifiques, loin d’être réductionnistes comme certains biologistes les
critiquent, sont un moyen de « décortiquer » un phénomène complexe dans ses éléments de bases,
éléments en interaction synergique que seuls des milliards d’années d’évolution ont pu construire
en se fondant sur des lois fondamentales de la physique, de la chimie et de la physico-chimie.
Références
[1] W. Almers et al., Nature 406, 2000, 849-854.
[2] E.L. Ciolkowski, K.M. Maness, P.S. Cahill, R.M. Wightman, D.H. Evans, B. Fosset, C.
Amatore. Anal. Chem., 66, 1994, 3611.
[3] C. Amatore, Y. Bouret, L. Midrier, Chem. Eur. J., 5, 1999, 2151-2162.
[4] C. Amatore, S. Arbault, Y. Chen, F. Lemaître, Y. Verchier, Angewandte Chemie, 2006.

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